Por Ana Paula da Silva Bertão

O e-DNA ou DNA ambiental é uma mistura complexa de DNA genômico oriundo de organismos inteiros ou partes deles, presentes em amostras ambientais. Essas amostras podem ser, por exemplo, de solo, água ou sedimento. O e-DNA permite a caracterização e o monitoramento da composição de espécies em ambientes de difícil coleta, como em rios, mares e baías. Sua principal aplicação é a análise ambiental, pois permite obter informações genômicas de diversas espécies.
A técnica de e-DNA foi desenvolvida em 1987 para a detecção de DNA microbiano em sedimento. Contudo, essa técnica passou a ser mais utilizada a partir do século XXI, quando os primeiros sequenciadores de DNA começaram a ser comercializados em meados de 2005.
Com os avanços da genética aplicada associadas à eficiência dos levantamentos de dados em e-DNA, essa ferramenta tem se tornado peça fundamental para a conservação de espécies nativas e para o monitoramento de ecossistemas aquáticos.
Para a identificação dos táxons presentes em uma amostra com e-DNA, é utilizada a técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). A PCR tem a finalidade de produzir uma grande quantidade de cópias de uma determinada parte do DNA, ou seja, consiste na amplificação “in vitro” de uma região específica de DNA.
Este método ocorre em três etapas:
Desnaturação- quando acontece a abertura das duas fitas do DNA (esta etapa ocorre com temperatura a 95º C).
Anelamento ou ligação dos primers- os primes ou iniciadores se ligam em uma das extremidades de cada fita separada, para a enzima polimerase iniciar a síntese da nova fita (60 a 64º C).
Extensão ou elongação- acontece a síntese da nova fita realizada pela enzima polimerase (72º C). Toda esta metodologia ocorre em aproximadamente 40 a 60 ciclos promovendo a amplificação da região que se pretende avaliar, conforme ilustrado na Figura 1.


Figura 1-Etapas da Reação em Cadeia da Polimerase PCR (Sanchéz, 2012).

Para a quantificação dos táxons utiliza-se a PCR em Tempo Real ou também denominada qPCR. A qPCR é uma variante da reação de PCR convencional, em que a amplificação e a detecção dos pares de bases dos nucleotídeos ocorrem simultaneamente. Consequentemente, o resultado é visualizado em tempo real durante a amplificação da sequência de interesse, com a possibilidade de gerar resultados quantitativos com maior precisão. Essa quantificação é mensurada pela quantidade de produtos amplificados durante cada ciclo (pela fluorescência emitida). Esta técnica utiliza um equipamento com sistema de monitoramento da emissão de fluorescência, como por exemplo o Termociclador de PCR em Tempo Real (qPCR).
A qPCR ou amplificação ocorre em três etapas:
Crescimento exponencial: acontece de forma rápida e precisa, devido à especificidade que a sonda fluorescente possui.
Crescimento linear: os produtos da reação são consumidos e iniciam o processo de degradação.
Estacionária: corresponde ao final da análise devido ao elevado nível de degradação dos produtos da PCR, ilustrada na Figura 2.


Figura 2- Etapas da amplificação a partir da qPCR (Arya et al. 2005).

O SYBR Green, é um corante do ácido desoxirribonucleico (DNA), utilizado na técnica de qPCR, que é adicionado ao DNA, gerando um sinal de fluorescência. Essa fluorescência é diretamente proporcional à quantidade de produto amplificado ao longo das diferentes fases.
As análises ambientais que utilizam a qPCR, possuem algumas vantagens que refletem nos resultados finais da análise. Pode-se citar o acompanhamento da reação em tempo real, em que os resultados são mais rápidos e precisos, quando comparados a outros métodos convencionais, permite a detecção de mais de um DNA alvo, facilita a quantificação e diminui a contaminação das amostras ambientais.

Aplicações do e-DNA
Pode ser aplicado em diversas áreas da pesquisa e tem sido fortemente recomendado para a identificação de espécies invasoras aquáticas, principalmente as de difícil detecção em fases iniciais do ciclo de vida. A detecção precoce destas espécies é considerada crucial para o manejo e controle da bioinvasão.
No Brasil, são encontradas duas espécies invasoras incrustantes oriundas do continente asiático, o molusco invasor mexilhão-dourado Limnoperna fortunei e o hidrozoário de água doce Cordylophora caspia. Ambas espécies possuem comportamento invasivo, incrustante e depositam material biológico para se instalarem/fixarem nos ambientes invadidos, causando diversos impactos econômicos e ecológicos.
Os impactos econômicos estão associados aos danos causados pelo entupimento de trocadores de calor de usinas hidrelétricas, estações de captação de água, bombas e tubulações. Os impactos ecológicos, são direcionados as espécies aquáticas nativas, que são afetadas e prejudicadas pela concorrência por espaços e alimentos, mudanças na estrutura da cadeia trófica e perturbação das comunidades aquáticas.
A detecção destas espécies através da técnica de e-DNA tem possibilitado ótimos resultados quanto à identificação, avaliação, monitoramento e proteção da biodiversidade local, permitindo melhor gerenciamento e conservação dos ecossistemas aquáticos. As vantagens das análises com e-DNA são evidenciadas quando comparadas aos métodos convencionais de identificação de organismos, como a utilização de lupas e microscópio estereoscópio. Pois, os métodos convencionais envolvem resultados morosos e propensos a erros durante a seleção de larvas ou na identificação das espécies.

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