{"id":1196,"date":"2014-11-19T20:27:08","date_gmt":"2014-11-19T22:27:08","guid":{"rendered":"https:\/\/gia.org.br\/portal\/sequenciamento-de-nova-geracao\/"},"modified":"2021-04-20T12:24:09","modified_gmt":"2021-04-20T15:24:09","slug":"sequenciamento-de-nova-geracao","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/gia.org.br\/portal\/sequenciamento-de-nova-geracao\/","title":{"rendered":"Sequenciamento de nova gera\u00e7\u00e3o"},"content":{"rendered":"

\"Capa<\/p>\n

SEQUENCIAMENTO DE NOVA GERA\u00c7\u00c3O PARA AN\u00c1LISES METAGEN\u00d4MICAS: ENFOQUE AO USO DO SEQUENCIADOR ILLUMINA<\/span><\/strong><\/p>\n

Por: Aline Horodesky<\/h4>\n

Publicado em 19\/11\/2014<\/h4>\n

As novas tecnologias de sequenciamento, denominadas de tecnologias de sequenciamento de nova gera\u00e7\u00e3o (Next Generation Sequencing<\/em>-NGS), come\u00e7aram a ser comercializadas em 2005 e est\u00e3o evoluindo rapidamente. Todas essas tecnologias promovem o sequenciamento de DNA em plataformas capazes de gerar informa\u00e7\u00e3o sobre milh\u00f5es de pares de bases em uma \u00fanica corrida.<\/span><\/p>\n

Apesar de se diferenciarem consideravelmente entre si todos os sequenciadores de NGS se baseiam no processamento paralelo massivo de fragmentos de DNA. Enquanto, um sequenciador de eletroforese processa, no m\u00e1ximo, 96 fragmentos por vez, os sequenciadores de nova gera\u00e7\u00e3o podem ler at\u00e9 bilh\u00f5es de fragmentos ao mesmo tempo.<\/span><\/p>\n

As plataformas de sequenciamento de nova gera\u00e7\u00e3o s\u00e3o uma alternativa poderosa para estudos de gen\u00f4mica estrutural e funcional.<\/span><\/p>\n

Atualmente, os sequenciadores est\u00e3o divididos em 1\u00aa gera\u00e7\u00e3o (Degrada\u00e7\u00e3o qu\u00edmica e Interrup\u00e7\u00e3o da cadeia-Sanger), 2\u00aa gera\u00e7\u00e3o (454-Roche, Illumina Genome Analyser-HiSeq\/MiSeq e SOLID), 3\u00aa gera\u00e7\u00e3o (Ion Torrent e PacBio RS) e 4\u00aa gera\u00e7\u00e3o (Nanopore). <\/span><\/p>\n

\"Figura<\/p>\n

Figura 1: Equipamentos utilizados para sequenciamento de DNA. 1\u00aa gera\u00e7\u00e3o (A) Sanger; 2\u00aa gera\u00e7\u00e3o (B) 454-Roche, (C) Illumina HiSeq, (D) Illumina MiSeq, (E) Solid; 3\u00aa gera\u00e7\u00e3o (F) Ion Torrent, (G) PacBio e 4\u00aa gera\u00e7\u00e3o (H) Nanopore.  <\/span><\/strong><\/p>\n

An\u00e1lises metagen\u00f4micas tradicionais utilizam a amplifica\u00e7\u00e3o, clonagem e determina\u00e7\u00e3o da sequ\u00eancia nucleot\u00eddica de DNA ribossomal, pelo m\u00e9todo de sequenciamento de DNA proposto por Sanger na d\u00e9cada de 70. Para isso, \u00e9 utilizada polimeriza\u00e7\u00e3o de DNA com incorpora\u00e7\u00e3o de dide\u00f3xinucleot\u00eddeos marcados, m\u00e9todo que foi grandemente automatizado na \u00faltima d\u00e9cada e meia, permitindo a execu\u00e7\u00e3o dos diversos<\/span> projetos-genoma. Por\u00e9m, abordagens metagen\u00f4micas modernas aplicam distintas t\u00e9cnicas de sequenciamento de segunda gera\u00e7\u00e3o, que permitem estudar genomas microbianos completos a partir de amostras ambientais, bem como identificar e pesquisar clusters g\u00eanicos funcionais codificando enzimas microbianas de interesse tecnol\u00f3gico, como lipases, despolimerases ou hidrolases para pol\u00edmeros complexos.<\/span><\/p>\n

O termo metagen\u00f4mica \u00e9 caracterizado pela aplica\u00e7\u00e3o de t\u00e9cnicas de biologia molecular que possibilitam a an\u00e1lise e caracteriza\u00e7\u00e3o de comunidades microbianas diretamente do ambiente natural, de forma independente do isolamento e cultivo dos microrganismos. Esse tipo de abordagem vem aprimorando e enriquecendo estudos filogen\u00e9ticos sobre o potencial biotecnol\u00f3gico de microrganismos antes n\u00e3o acessados e\/ou desconhecidos.<\/span><\/p>\n

Embora distintas, as t\u00e9cnicas de Sanger e NGS apresentam vantagens e desvantagens, assim como limita\u00e7\u00f5es de custo\/benef\u00edcio para obter e gerar dados. A escolha do m\u00e9todo depende principalmente do objetivo do trabalho proposto. <\/span><\/p>\n

A principal vantagem do m\u00e9todo de Sanger \u00e9, sem d\u00favida, o maior tamanho dos reads <\/em>gerados e a precis\u00e3o da base gerada (base calling)<\/em>, que tende a ser 10x maior que nos m\u00e9todos NGS; j\u00e1 para os m\u00e9todos de segunda gera\u00e7\u00e3o, a principal vantagem consiste na constru\u00e7\u00e3o in vitro <\/em>de bibliotecas gen\u00f4micas sem amplifica\u00e7\u00e3o de fragmentos de DNA e sem clonagem, como por exemplo, em Escherichia coli<\/em>. Portanto, em an\u00e1lises metagen\u00f4micas, \u00e9 vi\u00e1vel a utiliza\u00e7\u00e3o desses sequenciadores de segunda gera\u00e7\u00e3o, pois permite a constru\u00e7\u00e3o de grandes bibliotecas. Um dos principais sequenciadores indicado para este tipo de an\u00e1lise \u00e9 o Illumina.<\/span><\/p>\n

O sequenciador <\/span>Illumina Genome Analyzer <\/span><\/em>(Figura 2) produzido<\/span> em 2006, baseia-se no conceito de \u201csequenciamento por s\u00edntese\u201d o qual requer que as sequ\u00eancias a serem determinadas sejam convertidas numa biblioteca de sequenciamento especial, permitindo a amplifica\u00e7\u00e3o e imobiliza\u00e7\u00e3o das sequ\u00eancias para serem submetidas \u00e0 sequenciamento. Para este prop\u00f3sito, dois adaptadores diferentes s\u00e3o adicionados \u00e0s termina\u00e7\u00f5es 5\u2019 e 3\u2019 de todas as mol\u00e9culas.<\/span><\/p>\n

\"Figura<\/p>\n

Figura 2: Sequenciador Illumina MiSeq\/HiSeq.<\/span><\/strong><\/p>\n

A biblioteca de cadeia dupla \u00e9 desnaturada para obter DNAs de cadeia \u00fanica. Estas cadeias simples s\u00e3o dispostas em concentra\u00e7\u00f5es muito baixas pelos canais de uma c\u00e9lula de fluxo. Esta \u201c<\/span>flow cell<\/span><\/em>\u201d possui na sua superf\u00edcie dois tipos de oligonucleot\u00eddeos imobilizados complementares aos dois adaptadores, utilizados para produzir a biblioteca de sequenciamento. Estes oligonucleot\u00eddeos hibridizam com as mol\u00e9culas das cadeias das bibliotecas. Por s\u00edntese reversa, come\u00e7ando pela zona hibridizada, a nova mol\u00e9cula que est\u00e1 sendo criada encontra-se covalentemente ligada \u00e0 <\/span>flow cell <\/span><\/em>(Figura 3<\/span>)<\/span><\/em>.<\/span><\/p>\n

Esta nova mol\u00e9cula dobra-se e liga-se a outro oligonucleot\u00eddeo complementar ao segundo adaptador que n\u00e3o est\u00e1 ligado \u00e0 placa, podendo ser usado para sintetizar uma segunda cadeia ligada tamb\u00e9m covalentemente \u00e0 placa. Este processo de dobra da mol\u00e9cula e de s\u00edntese reversa, chamada de amplifica\u00e7\u00e3o em ponte, \u00e9 repetida v\u00e1rias vezes e cria aglomerados de milhares de c\u00f3pias da sequ\u00eancia original, muito pr\u00f3ximos na c\u00e9lula de fluxo.<\/span><\/p>\n

Estes aglomerados distribu\u00eddos aleatoriamente cont\u00eam c\u00f3pias id\u00eanticas da mesma sequ\u00eancia. Deste modo as bibliotecas est\u00e3o prontas para serem sequenciadas.<\/span><\/p>\n

\"Figura<\/p>\n

Figura 3: O processo de sequenciamento do Illumina.<\/span><\/strong><\/p>\n

No analisador de genoma, milh\u00f5es de aglomerados s\u00e3o sequenciados simultaneamente. As mol\u00e9culas de DNA s\u00e3o sequenciadas base a base em paralelo usando quatro nucle\u00f3tideos marcados com fluoresc\u00eancia. As quatro bases completam umas com as outras para se ligar ao alvo, esta competi\u00e7\u00e3o natural garante a alta precis\u00e3o. Depois de cada s\u00edntese os fluorocromos s\u00e3o excitados por um laser, a cor obtida identifica a base que foi adicionada. Este fluorocromo \u00e9 depois retirado para que a pr\u00f3xima base possa se ligar ao template<\/em>, e ent\u00e3o \u00e9 lida cada base adicionada em cada ciclo.<\/span><\/p>\n

REFER\u00caNCIA CONSULTADA<\/span><\/strong><\/p>\n

Carvalho, M. C. G. & Silva, D. C. G. 2010. Sequenciamento de DNA de nova gera\u00e7\u00e3o e suas aplica\u00e7\u00f5es na gen\u00f4mica de plantas. Ci\u00eancia Rural, vol. 40, Santa Maria.<\/span><\/p>\n

Dick, G. J., Andersson, A. F., Baker, B. J., Simmons, S. L., Thomas, B. C., Yelton A. P., Banfield, J. F. 2009. Community-wide analysis of microbial genome sequence signatures. Genome Biology. v. 10, p. R85-1 a R85-16.<\/span><\/p>\n

Duarte, E. A. Sequenciamento de segunda gera\u00e7\u00e3o: Implica\u00e7\u00f5es nos estudos metagen\u00f4micos. <\/span>Universidade Estadual de Santa Cruz.<\/span><\/p>\n

Handelsman, J. 2004. Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiology and molecular biology reviews. v. 68, p.669-685.<\/span><\/p>\n

Hoff, K. J., Lingner, T., Meinicke, P., Tech, M. 2009. Orphelia: predicting genes in metagenomic sequencing. Nucleic Acids Research. v. 37, p. W101-W105.<\/span><\/p>\n

Kircher, M., Kelso, J. 2010. High-throughput DNA sequencing–concepts and limitations. Bioessays, 32, p.524-36.<\/span><\/p>\n

Kunin, V., Copeland, A., Lapidus, A., Mavromatis, K., Hugenholtz, P. 2008. A bioinformatician’s guide to metagenomics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. v. 557-578.<\/span><\/p>\n

Mardis, E. R. 2008. Next-generation DNA sequencing methods. Annual Review of Genomics Human Genetics, 9, 387-402.<\/span><\/p>\n

Moreno, A. C. A. 2013. Diagn\u00f3stico molecular na era da sequencia\u00e7\u00e3o de 3\u00aa gera\u00e7\u00e3o e da PCR digital. Disserta\u00e7\u00e3o de Mestrado. Universidade Fernando Pessoa.<\/span><\/p>\n

Steele, H.; Streit, W.R. 2005. Metagenomics: Advances in ecology and Biotechnology. <\/span>FEMS Microbiology Letters. v. 247, p. 105-111.<\/span><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

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